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ELISA試劑盒時許多重要的環(huán)節(jié)都會影響到ELISA試劑盒檢測的質(zhì)量。

下面與大家分享幾種方法：

一、方法學(xué)的影響

ELISA測定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競爭抑制法，其中競爭抑制法因受操作時差所引起的競爭等因素的影響，結(jié)果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難控制。

二、試劑因素

（1）試劑的選擇

免疫檢測的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。ELISA試劑盒由于該反應(yīng)過程受多種因素的影響，如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等，因而檢測結(jié)果難以溯源，不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測的水平，因此在引入新項目之前必須對試劑進行嚴格的評估。試劑的評估有以下幾個步驟：⑴確定開展該項目的必要性；⑵了解該項目現(xiàn)有的檢測方法和原理；⑶在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進行比較，判斷標準參考方法或參考物質(zhì)，其次為的滿意度及機構(gòu)的報告如各級室間質(zhì)量評價、CDC報告等；⑷定期對檢測結(jié)果進行追蹤反饋直至認可該試劑。

（2）試劑的準備

不同批次的ELISA試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量一致，即使是通過批批檢的項目其檢測結(jié)果也存在差異，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件。嚴格執(zhí)行這一標準可以避免因試劑批號改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性；對于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。

試劑使用前必須平衡至室溫，否則會影響檢測下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。

三、樣本因素

標本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素，ELISA試劑盒前者包括類風濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、等，后者包括標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間過長、標本凝固不全、冷凍標本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們在檢測過程中可以避免也是必須避免的因素，而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過選擇合適的試劑盒。在中遇到少見的疑難病例時應(yīng)當考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對外源性干擾因素進行簡要說明：

（1）標本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）為標記酶的ELISA測定中，如果血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。

（2）標本被細菌污染 標本的采集及血清分離要注意盡量避免細菌污染。細菌菌體中除可能含有內(nèi)源酶對測定產(chǎn)生非特異性干擾外，還可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。另外標本在保存中出現(xiàn)渾濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。

（3）標本貯存時間過長 標本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底加深、甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常情況下血清標本可在2～8℃下保存l周，冷凍保存時間會更長，但對于抗體或抗原含量低的標本而言，則可能會因抗體掉價、抗原分解而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

（4）ELISA試劑盒標本凝固不全 血液通常在采集后半小時后開始凝固，18～24h凝固。如果在血液未凝固時即離心分離血清，則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。為了縮短標本處理時間，可以在離心前將血液標本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽┮约铀傺宓姆蛛x。

（5）冷凍保存標本避免反復(fù)凍融 標本的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價跌落從而引起假陰性結(jié)果，ELISA試劑盒所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝凍存。此外，標本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標本必須混勻，但不要進行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒即可。 

上海通蔚生物技術(shù)員提醒顧客注意事項：“切勿使用過多的檢測試劑！如果濃度過高，或者未正確稀釋，則會導(dǎo)致高背景。ELISA試劑盒也不要顯色過度，如有必要，優(yōu)化一下何時應(yīng)加入終止液。